Plynová chromatografie-hmotnostní spektrometrie

Historie

První výzkumné práce o chromatografii plyn-kapalina byly publikovány v roce 1950. Chemici používali různé detektory, aby zjistili, že sloučeniny vytékají z konce chromatografu. Většina detektorů sloučeniny ničila, protože je spalovala nebo ionizovala. Tyto detektory nechávaly chemiky hádat přesnou identitu každé sloučeniny ve vzorku. V 50. letech 20. století Roland Gohlke a Fred McLafferty vyvinuli nový kombinovaný přístroj. Jako detektor v plynové chromatografii použili hmotnostní spektrometr. Tato raná zařízení byla velká, křehká a původně omezená na laboratorní prostředí.

Návrh byl složitý. Bylo obtížné kontrolovat časový interval mezi jednotlivými sloučeninami vystupujícími z chromatografu. Hmotnostní spektrometr tak musel dokončit práci s jednou sloučeninou dříve, než z chromatografu vytekla další. V prvních modelech se měření z hmotnostního spektrometru zaznamenávala na grafický papír. Vysoce vyškolení chemici studovali vzorce píků, aby identifikovali jednotlivé sloučeniny. V 70. letech 20. století byly k hmotnostním spektrometrům přidány analogově-digitální převodníky. To umožnilo počítačům ukládat a interpretovat výsledky. Jak se počítače zrychlovaly a zmenšovaly, GC-MS se zrychlovala a rozšířila se z laboratoří do každodenního života. Dnes se počítačové přístroje GC-MS široce používají při monitorování životního prostředí, vody, vzduchu a půdy. Používají se také při regulaci zemědělství, bezpečnosti potravin a při objevování a výrobě léků.

Vývoj malých počítačů přispěl ke zjednodušení GC-MS strojů. Výrazně se také zkrátila doba potřebná k analýze vzorku. Společnost Electronic Associates, Inc. (EAI) byla předním americkým dodavatelem analogových počítačů. V roce 1964 zahájila společnost EAI pod vedením Roberta E. Finnigana vývoj počítačem řízeného hmotnostního spektrometru. Do roku 1966 bylo prodáno více než 500 přístrojů pro analýzu plynů. V roce 1967 byla založena společnost Finnigan Instrument Corporation (FIC). Počátkem roku 1968 dodala první prototyp čtyřpólových GC-MS přístrojů na Stanfordovu a Purdueovu univerzitu. Společnost FIC byla nakonec přejmenována na Finnigan Corporation a postupně se prosadila jako světová jednička v oblasti systémů GC-MS.

Základní operace

GC-MS dokáže najít všechny sloučeniny smíchané dohromady v objektu vzorku. Operátor rozpustí vzorek v kapalině. Poté operátor vstříkne kapalinu do proudu plynu. (Nejčastěji se používá helium, vodík nebo plynný dusík.) Plyn proudí trubicí se speciálním povlakem. Protože každá sloučenina ve vzorku ulpívá na povlaku jiným způsobem, každá sloučenina vychází ze zkumavky v jinou dobu. Povlak se tedy používá k oddělení každé sloučeniny, která byla ve vzorku smíchána dohromady. Jakmile každá sloučenina vyjde na konci trubice, je ionizována a získá elektrický náboj. Většina sloučenin se při ionizaci rozpadne. Jednotlivé kousky proletí pod magnetem, který je oddělí na základě jejich hmotnosti a náboje. Počítač pak změří všechny kousky každé sloučeniny. Porovnáním měření s počítačovou knihovnou známých sloučenin počítač vytvoří seznam názvů všech sloučenin ve vzorku. Počítač také dokáže určit, kolik každé sloučeniny bylo ve vzorku.

Přístrojové vybavení

GC-MS se skládá ze dvou hlavních stavebních prvků: plynového chromatografu a hmotnostního spektrometru. Plynový chromatograf používá kapilární kolonu, což závisí na rozměrech kolony (délka, průměr, tloušťka vrstvy) a také na vlastnostech fáze (např. 5 % fenyl polysiloxanu). Rozdíl v chemických vlastnostech mezi různými molekulami ve směsi oddělí molekuly, jak vzorek putuje po délce kolony. Molekuly potřebují různě dlouhou dobu (nazývanou retenční čas), než vyjdou z plynového chromatografu (eluují se z něj). To umožňuje hmotnostnímu spektrometru, který se nachází za chromatografem, zachytit, ionizovat, urychlit, vychýlit a detekovat ionizované molekuly odděleně. Hmotnostní spektrometr to dělá tak, že každou molekulu rozloží na ionizované fragmenty a tyto fragmenty detekuje pomocí poměru hmotnosti a náboje.

Tyto dva přístroje používané společně umožňují mnohem přesnější identifikaci látek než každá z nich samostatně. Samotnou plynovou chromatografií nebo hmotnostní spektrometrií nelze provést přesnou identifikaci konkrétní molekuly. Proces hmotnostní spektrometrie obvykle vyžaduje velmi čistý vzorek. V minulosti se v plynové chromatografii používaly jiné detektory, například plamenový ionizační detektor. Tyto detektory nedokážou oddělit různé molekuly, kterým náhodou trvá cesta kolonou stejně dlouho. (Když mají dvě různé molekuly stejný retenční čas, říká se, že "koelují".) Koelutující molekuly zmatou počítačové programy, které čtou jedno hmotnostní spektrum pro obě molekuly.

Někdy mohou mít dvě různé molekuly také podobný vzorec ionizovaných fragmentů v hmotnostním spektrometru (hmotnostní spektrum). Kombinace obou procesů snižuje možnost chyby. Je velmi nepravděpodobné, že by se dvě různé molekuly chovaly stejně jak v plynovém chromatografu, tak v hmotnostním spektrometru. Pokud tedy hmotnostní spektrum odpovídá analytu, který vás zajímá, lze retenční čas tohoto spektra porovnat s charakteristickým retenčním časem GC, čímž se zvýší jistota, že se analyt ve vzorku nachází.

Typy detektorů hmotnostních spektrometrů

Nejběžnějším typem MS spojeným s GC je kvadrupólový hmotnostní spektrometr. Společnost Hewlett-Packard (nyní Agilent) jej prodává pod obchodním názvem "Mass Selective Detector" (MSD). Dalším relativně běžným detektorem je hmotnostní spektrometr s iontovou pastí. Kromě toho se lze setkat s hmotnostním spektrometrem s magnetickým sektorem. Tyto konkrétní přístroje jsou však drahé a objemné a obvykle se nevyskytují ve vysoce výkonných servisních laboratořích. Používají se i jiné detektory, například detektor času letu (TOF), tandemové kvadrupóly (MS-MS) (viz níže) nebo v případě iontové pasti MS ⁿ. Písmeno n označuje počet stupňů hmotnostní spektrometrie.

Vnitřek GC-MS s kolonou plynového chromatografu v peci vpravo.


Schéma GC-MS

Analýza

Hmotnostní spektrometr se obvykle používá jedním ze dvou způsobů: Plné skenování nebo selektivní monitorování iontů (SIM). Typický GC-MS může pracovat buď samostatně, nebo oběma způsoby současně.

Úplné skenování MS

Při sběru dat v režimu úplného skenování se vybere cílový rozsah hmotnostních fragmentů a vloží se do metody přístroje. Příkladem typického širokého rozsahu sledovaných hmotnostních fragmentů je m/z 50 až m/z 400. Určení rozsahu, který se má použít, je do značné míry dáno tím, co se očekává ve vzorku, přičemž je třeba brát v úvahu rozpouštědlo a další možné interference. Pokud MS hledá hmotnostní fragmenty s velmi nízkými m/z, může detekovat vzduch nebo jiné možné rušivé faktory. Použití velkého rozsahu skenování snižuje citlivost přístroje. Přístroj provede méně skenů za sekundu, protože každý sken zabere více času na detekci širšího rozsahu hmotnostních fragmentů.

Úplné skenování je užitečné při stanovení neznámých sloučenin ve vzorku. Poskytuje více informací než SIM, pokud jde o potvrzení nebo rozlišení sloučenin ve vzorku. Většina přístrojů je řízena počítačem, který obsluhuje počítačový program nazývaný "přístrojová metoda". Přístrojová metoda řídí teplotu v GC, rychlost MS skenování a rozsah detekovaných velikostí fragmentů. Když chemik vyvíjí přístrojovou metodu, posílá testovací roztoky přes GS-MS v režimu plného skenování. Tím se zkontroluje retenční čas GC a otisk hmotnostního fragmentu před přechodem na přístrojovou metodu SIM. Specializované přístroje GC-MS, jako jsou detektory výbušnin, mají přístrojovou metodu předinstalovanou z výroby.

Monitorování vybraných iontů

Při monitorování vybraných iontů (SIM) se přístrojová metoda zaměřuje na určité iontové fragmenty. Hmotnostní spektrometr detekuje pouze tyto fragmenty. Výhodou metody SIM je nižší detekční limit, protože přístroj při každém skenování sleduje pouze malý počet fragmentů (např. tři fragmenty). Každou sekundu může proběhnout více skenů. Protože se sleduje pouze několik hmotnostních fragmentů, které jsou předmětem zájmu, jsou matricové interference obvykle nižší. Aby se zvýšila šance na správné odečtení pozitivního výsledku, jsou poměry iontů různých hmotnostních fragmentů srovnatelné se známým referenčním standardem.

Typy ionizace

Poté, co molekuly projdou celou délkou kolony, projdou přenosovou linkou a vstoupí do hmotnostního spektrometru, jsou různými metodami ionizovány. Obvykle se v daném okamžiku používá pouze jedna ionizační metoda. Jakmile je vzorek fragmentován, je detekován, obvykle pomocí elektronové násobicí diody. Dioda zpracovává ionizovaný hmotnostní fragment jako elektrický signál, který je následně detekován.

Chemici si vybírají ionizační techniku odděleně od výběru monitorování Full Scan nebo SIM.

Ionizace elektronů

Nejběžnějším typem ionizace je elektronová ionizace (EI). Molekuly vstupují do MS (zdrojem je kvadrupól nebo samotná iontová past v MS s iontovou pastí), kde na ně dopadají volné elektrony emitované z vlákna. To je podobné vláknu, které se nachází v běžné žárovce. Elektrony dopadají na molekuly a způsobují jejich fragmentaci charakteristickým způsobem, který se může opakovat. Tato technika "tvrdé ionizace" vede ke vzniku většího počtu fragmentů s nízkým poměrem hmotnosti a náboje (m/z). EI má jen málo fragmentů, pokud vůbec nějaké, které mají hmotnost blízkou hmotnosti původní molekuly. Chemici považují tvrdou ionizaci za vystřelování elektronů do molekul vzorku. Naproti tomu "měkká ionizace" je přivedení náboje na molekulu vzorku tím, že na ni dopadne zavedený plyn. Vzor fragmentace molekul závisí na energii elektronů aplikované na systém, obvykle 70 eV (elektronvoltů). Použití 70 eV pomáhá porovnat spektra generovaná ze zkušebního vzorku se známými spektry z knihovny. (Knihovní spektra mohou pocházet ze softwaru dodaného výrobcem nebo ze softwaru vyvinutého Národním institutem pro standardy (NIST-USA)). Software prohledává spektra z knihovny pomocí porovnávacího algoritmu, jako je například porovnávání na základě pravděpodobnosti nebo porovnávání pomocí bodového součinu. Tyto algoritmy a metody nyní kontroluje mnoho agentur pro standardizaci metod, aby byla zajištěna jejich objektivita.

Chemická ionizace

Při chemické ionizaci (CI) se do hmotnostního spektrometru přivádí plynné činidlo, obvykle metan nebo amoniak. Existují dva typy CI: pozitivní CI nebo negativní CI. V obou případech reagenční plyn interaguje s elektrony a analytem a způsobí "měkkou" ionizaci molekuly, která je předmětem zájmu. Měkčí ionizace fragmentuje molekulu v nižší míře než tvrdá ionizace EI. Chemici dávají přednost CI před EI. Je to proto, že CI vytváří alespoň jeden hmotnostní fragment, jehož hmotnost je téměř stejná jako molekulová hmotnost analytu, který je předmětem zájmu.

Pozitivní chemická ionizace

Při pozitivní chemické ionizaci (PCI) reagující plyn interaguje s cílovou molekulou, nejčastěji výměnou protonů. Tím vzniká iontový druh v relativně vysokém množství.

Negativní chemická ionizace

Při negativní chemické ionizaci (NCI) snižuje plynné činidlo dopad volných elektronů na cílový analyt. Tato snížená energie obvykle zanechává fragment ve velké zásobě. (Fragmenty se dále nerozpadají.)

Výklad

Hlavním cílem přístrojové analýzy je změřit množství látky. To se provádí porovnáním relativních koncentrací mezi atomovými hmotnostmi v generovaném hmotnostním spektru. Jsou možné dva druhy analýzy, srovnávací a původní. Srovnávací analýza v podstatě porovnává dané spektrum s knihovnou spekter, aby zjistila, zda se jeho charakteristiky vyskytují u některého známého vzorku v knihovně. Tuto analýzu je nejlépe provádět pomocí počítače, protože v důsledku změn měřítka může dojít k mnoha vizuálním zkreslením. Počítače mohou také korelovat více údajů (například retenční časy identifikované GC), aby bylo možné přesněji propojit určité údaje.

Další metoda analýzy měří vrcholy ve vzájemném vztahu. Při této metodě je nejvyšší vrchol nastaven na 100 %. Ostatním píkům se přiřadí hodnota rovnající se poměru výšky píku k výšce nejvyššího píku. Všechny hodnoty vyšší než 3 % jsou přiřazeny. Celková hmotnost neznámé sloučeniny se obvykle udává podle mateřského píku. Hodnotu tohoto mateřského píku lze použít k dosazení do chemického vzorce obsahujícího různé prvky, o nichž se předpokládá, že jsou ve sloučenině obsaženy. Izotopový vzorec ve spektru je jedinečný pro prvky, které mají mnoho izotopů. Lze jej tedy také použít k identifikaci různých přítomných prvků. To vypovídá o celkovém chemickém vzorci neznámé molekuly. Protože se struktura molekuly a vazby rozpadají charakteristickými způsoby, lze je identifikovat na základě rozdílu v hmotnostech píků. Identifikovaná struktura molekuly musí být v souladu s charakteristikami zaznamenanými pomocí GC-MS. Obvykle se tato identifikace provádí automaticky pomocí počítačových programů dodávaných s přístrojem. Tyto programy porovnávají spektra s knihovnou známých sloučenin, které mají stejný seznam prvků, jež by mohly být přítomny ve vzorku.

Analýza "celého spektra" bere v úvahu všechny "vrcholy" ve spektru. Selektivní monitorování iontů (SIM) však sleduje pouze vybrané píky spojené s určitou látkou. Chemici předpokládají, že v daném retenčním čase je pro určitou sloučeninu charakteristický soubor iontů. SIM je rychlá a účinná analýza. SIM funguje nejlépe, pokud má analytik předchozí informace o vzorku nebo pokud hledá pouze několik konkrétních látek. Když se množství shromážděných informací o iontech v daném píku plynové chromatografie sníží, citlivost analýzy se zvýší. Analýza SIM tedy umožňuje detekovat a měřit menší množství sloučeniny. Snižuje se však míra jistoty o identitě této sloučeniny.

GC-tandemová MS

Pokud se přidá druhá fáze hmotnostní fragmentace, například pomocí druhého kvadrupólu v kvadrupólovém přístroji, nazývá se tandemová MS (MS/MS). MS/MS jsou vhodné pro měření nízkých hladin cílových sloučenin ve vzorku s matricí sloučenin v pozadí, které nejsou předmětem zájmu.

První kvadrupól (Q1) je spojen s kolizní buňkou (q2) a dalším kvadrupólem (Q3). Oba kvadrupóly lze použít ve skenovacím nebo statickém režimu v závislosti na typu použité MS/MS analýzy. Mezi typy analýzy patří skenování produktových iontů, skenování prekurzorových iontů, monitorování vybraných reakcí (SRM) a skenování neutrálních ztrát. Např: Pokud je Q1 ve statickém režimu (sleduje se pouze jedna hmotnost jako v SIM) a Q3 je v režimu skenování, získá se tzv. produktové iontové spektrum (nazývané také "dceřiné spektrum"). Z tohoto spektra lze vybrat výrazný produktový ion, který může být produktovým iontem pro zvolený prekurzorový ion. Tato dvojice se nazývá "přechod" a tvoří základ pro SRM. SRM je vysoce specifická a téměř zcela eliminuje matricové pozadí.

Aplikace

Monitorování a čištění životního prostředí

Mnoho chemiků se domnívá, že GC-MS je nejlepším nástrojem pro monitorování organických znečišťujících látek v životním prostředí. Náklady na vybavení GC-MS se velmi snížily. Zároveň se zvýšila spolehlivost GC-MS. Obě zlepšení zvýšila využití ve studiích životního prostředí. Některé sloučeniny, například některé pesticidy a herbicidy, nelze pomocí GS-MS identifikovat. Jsou příliš podobné jiným příbuzným sloučeninám. Pro většinu organických analýz vzorků životního prostředí, včetně mnoha hlavních tříd pesticidů, je však GC-MS velmi citlivá a účinná.

Kriminalistika

GC-MS může analyzovat částice z lidského těla a pomoci tak spojit zločince s trestným činem. Zákon připouští použití GC-MS k analýze zbytků po požáru. Americká společnost pro testování materiálů (American Society for Testing Materials, ASTM) má ve skutečnosti normu pro analýzu zbytků po požáru. GCMS/MS je zde obzvláště užitečná, protože vzorky často obsahují velmi složité matrice a výsledky, které se používají u soudu, musí být velmi přesné.

Vymáhání práva

GC-MS se používá k detekci nelegálních narkotik a časem může nahradit psy na vyhledávání drog. Běžně se používá také ve forenzní toxikologii. Pomáhá najít drogy a/nebo jedy v biologických vzorcích odebraných podezřelým, obětem nebo mrtvému tělu.

Zabezpečení

Po teroristických útocích z 11. září 2001 se systémy pro detekci výbušnin staly součástí všech amerických letišť. Tyto systémy využívají řadu technologií, z nichž mnohé jsou založeny na GC-MS. Existují pouze tři výrobci, kteří mají od FAA certifikaci pro poskytování těchto systémů. Prvním je Thermo Detection (dříve Thermedics), který vyrábí systém EGIS, řadu detektorů výbušnin na bázi GC-MS. Druhým je Barringer Technologies, který je nyní vlastněn společností Smith's Detection Systems. Třetí je Ion Track Instruments (součást General Electric Infrastructure Security Systems).

Analýza potravin, nápojů a parfémů

Potraviny a nápoje obsahují velké množství aromatických látek, z nichž některé jsou přirozeně obsaženy v surovinách a některé vznikají při zpracování. GC-MS se hojně využívá k analýze těchto sloučenin, mezi něž patří estery, mastné kyseliny, alkoholy, aldehydy, terpeny atd. Používá se také k detekci a měření kontaminantů pocházejících z kažení nebo falšování, které mohou být škodlivé. Tyto kontaminanty jsou často kontrolovány vládními agenturami, například pesticidy.

Astrochemie

Zemi opustilo několik GC-MS. Dva se vydaly na Mars v rámci programu Viking. Venera 11 a 12 a Pioneer Venus analyzovaly atmosféru Venuše pomocí GC-MS. Sonda Huygens v rámci mise Cassini-Huygens vysadila jeden GC-MS na největším Saturnově měsíci Titanu. Materiál v kometě 67P/Churyumov-Gerasimenko bude analyzovat mise Rosetta pomocí chirální GC-MS v roce 2014.

Léky

GC-MS se používají při screeningových testech novorozenců. Tyto testy mohou odhalit desítky vrozených metabolických onemocnění (známých také jako vrozené metabolické chyby). GC-MS dokáže stanovit sloučeniny v moči i ve velmi malém množství. Tyto sloučeniny se normálně nevyskytují, ale objevují se u jedinců trpících metabolickými poruchami. To se stává běžným způsobem diagnostiky IEM pro včasnější stanovení diagnózy a zahájení léčby. To v konečném důsledku vede k lepším výsledkům. V současné době je možné testovat novorozence na více než 100 genetických metabolických poruch pomocí vyšetření moči při narození na základě GC-MS.

V kombinaci s izotopovým značením metabolických sloučenin se GC-MS používá ke stanovení metabolické aktivity. Většina aplikací je založena na použití ¹³C jako značení a měření poměru ¹³C-¹² C pomocí hmotnostního spektrometru s izotopovým poměrem (IRMS). IRMS je hmotnostní spektrometr s detektorem určený k měření několika vybraných iontů a k vracení hodnot jako poměrů.