V roce 539 př. n. l. padla novobabylonská říše v bitvě u Opisu pod vládou
perského krále Kýra Velikého. Babylonské hradby byly velmi vysoké a silné. Jediná cesta do města vedla přes jednu z mnoha bran. Vedle hradeb protékal Eufrat a Kýros se rozhodl využít řeku, aby se dostal do města. Kýrova vojska odklonila řeku Eufrat. Tím se hladina řeky snížila a vojáci mohli vstoupit do města.
Babylóňané ten večer uspořádali oslavu. Perská armáda obsadila většinu města dříve, než se Babylóňané dozvěděli, že se Peršané dostali do města. O této události podal zprávu Hérodotos a je zmíněna také v hebrejské Bibli. Kýros se zmocnil města tak, že prošel babylonskými branami, aniž by opilí Babylóňané kladli téměř žádný odpor.
Kýros později vydal dekret, který lidem, včetně Židů, umožnil návrat do jejich země. O tom se zmiňuje Starý zákon. Umožnil obnovení židovského chrámu v Jeruzalémě.
Za Kýra a následného perského krále Dareia Velikého se Babylon stal hlavním městem 9. satrapie (Babylonie na jihu a Athury na severu). Bylo centrem vzdělanosti a vědeckého pokroku. V achaimenovské Persii došlo k oživení babylonského umění astronomie a matematiky. Babylonští učenci sestavovali mapy souhvězdí. Město bylo správním hlavním městem Perské říše. Tato říše byla nejmocnější v celém tehdy známém světě. Bylo učiněno mnoho významných archeologických objevů, které zlepšují naše znalosti o této době.
První perští králové se snažili zachovat Mardukovy náboženské obřady. Za vlády Dareia III. vedlo nadměrné zdanění a četné války k chátrání hlavních babylonských svatyní a kanálů a k rozpadu regionu. Navzdory třem povstáním v letech 522 př. n. l., 521 př. n. l. a 482 př. n. l. zůstaly země a město Babylon po dvě století pod perskou nadvládou. V roce 331 př. n. l. se vlády ujal Alexandr Veliký. Pod vládou Parthské říše se Babylon nadále zmenšoval a ztrácel na významu.