Řízená evoluce
Řízená evoluce (DE) je metoda používaná k výrobě enzymů pro průmyslové nebo lékařské účely.
Metodou je proteinové inženýrství, které napodobuje přirozený výběr.
Základní myšlenka spočívá v tom, že gen prochází opakovanými koly mutací a vytváří se tak knihovna variant. Selekcí se izolují geny s požadovanou funkcí. Ty jsou předlohou pro další kolo.
To lze provést in vivo (v živých buňkách bakterií nebo kvasinek) nebo in vitro (volně v roztoku nebo v mikrodestičkách).
Testování většího počtu mutantů zvyšuje šanci na nalezení mutanta s požadovanými vlastnostmi.
Během evoluce in vivo je každá buňka (obvykle bakterie nebo kvasinka) transformována plazmidem obsahujícím jiný člen knihovny variant. Mezi buňkami se liší pouze gen, který je předmětem zájmu, ostatní geny zůstávají stejné.
Buňky exprimují protein buď v cytoplazmě, nebo na povrchu, kde lze testovat jeho funkci. Výhodou tohoto formátu je výběr vlastností v buněčném prostředí, což je užitečné, pokud má být vyvinutý protein nebo RNA použit v živých organismech.
Pokud se DE provádí bez buněk, používá se in vitro transkripční translace k produkci proteinů nebo RNA volně v roztoku nebo v umělých mikrokapičkách. To má tu výhodu, že umožňuje více podmínek (např. teplota, rozpouštědla). Lze tak exprimovat proteiny, které by byly pro buňky toxické. Kromě toho mohou experimenty s evolucí in vitro vytvářet mnohem větší knihovny (až 1015), protože DNA knihovny nemusí být vložena do buněk. To často omezuje možnosti, které lze provádět.
Příklad řízené evoluce ve srovnání s přirozenou evolucí. Vnitřní cyklus ukazuje tři fáze cyklu řízené evoluce s napodobeným přírodním procesem v závorce. Vnější kruh ukazuje kroky v typickém experimentu. Červené symboly označují funkční varianty, světlé symboly označují varianty se sníženou funkcí
Zajištění dědičnosti
Pokud byly izolovány funkční proteiny, je nutné, aby byly izolovány i jejich geny, proto je nutná vazba genotyp-fenotyp.
To může být kovalentní, kdy je gen mRNA spojen s proteinem na konci translace pomocí puromycinu.
Alternativně lze protein a jeho gen uchovávat společně nebo v emulzních kapkách. Izolované genové sekvence se pak množí pomocí PCR nebo transformovaných hostitelských bakterií. Jako templát pro další kolo mutageneze lze použít buď jedinou nejlepší sekvenci, nebo soubor sekvencí. Opakované cykly diverzifikace-selekce-amplifikace vytvářejí variace enzymů přizpůsobené procesu selekce.
Expresní protein může být kovalentně spojen se svým genem (jako mRNA), vlevo, nebo s ním může být umístěn do stejného prostoru, vpravo. V obou případech je gen, který protein kóduje, izolován.
Udělená cena
Americká inženýrka Frances Arnoldová získala Technologickou cenu tisíciletí za průkopnictví v oblasti řízené evoluce.
Otázky a odpovědi
Otázka: Co je to usměrněný vývoj?
Odpověď: Řízená evoluce (DE) je metoda používaná k výrobě enzymů pro průmyslové nebo lékařské účely. Je to forma proteinového inženýrství, která napodobuje přírodní výběr.
Otázka: Jak řízená evoluce funguje?
Odpověď: Řízená evoluce funguje tak, že gen prochází opakovanými koly mutací a vytváří knihovnu variant. Selekce pak izoluje geny s požadovanou funkcí, které se pak použijí jako šablony pro další kolo.
Otázka: Kde lze řízenou evoluci provádět?
Odpověď: Řízenou evoluci lze provádět in vivo (v živých buňkách bakterií nebo kvasinek) nebo in vitro (volně v roztoku nebo v mikrokapičkách).
Otázka: Jaké jsou výhody řízené evoluce in vivo?
Odpověď: Výhodou řízené evoluce in vivo je výběr vlastností v buněčném prostředí, což je užitečné, pokud má být vyvinutý protein nebo RNA použit v živých organismech.
Otázka: Jaké jsou výhody řízené evoluce in vitro?
Odpověď: Řízená evoluce in vitro má tu výhodu, že umožňuje více podmínek (např. teplota, rozpouštědla) a lze při ní exprimovat proteiny, které by byly pro buňky toxické. Kromě toho lze vytvářet mnohem větší knihovny, protože DNA není třeba vkládat do buněk.
Otázka: Co omezuje to, co lze během experimentu in vitro provádět?
Odpověď: Velikostní omezení toho, co lze během experimentu in vitro dělat, je často určeno tím, kolik DNA je třeba vložit do buněk.
