Reverzní transkriptáza (RT): enzym přepisující RNA na DNA
Reverzní transkriptáza: jak enzym přepisuje RNA na DNA, mechanismus, role ve virologii, výzkumu a biotechnologiích — přehled funkcí a významu.
Reverzní transkriptáza je enzym, který pracuje "pozpátku", tedy od RNA k DNA. Normální transkripce zahrnuje syntézu RNA z DNA; reverzní transkripce je opačný proces. Jedná se o enzym DNA polymerázu, který přepisuje jednořetězcovou RNA do jednořetězcové DNA. Syntetizuje také druhé vlákno DNA komplementární k reverzně přepsané jednořetězcové cDNA. Proces často probíhá ve dvou krocích: nejprve vznikne RNA–DNA hybrid (první vlákno cDNA) a poté je pomocí RNázy H odstraněné původní RNA a syntetizováno druhé DNA vlákno, čímž vznikne dvouvláknová DNA.
Mechanismus a vlastnosti
Reverzní transkriptázy využívají krátké primery (např. oligo-dT, náhodné hexamery nebo genově-špecifické primery) pro zahájení syntézy DNA z RNA templátu. Pro katalytickou aktivitu obvykle vyžadují ionty kovů (Mg2+ nebo Mn2+). Mnoho virových RT nemá 3'→5' exonukleázovou korekční (proofreading) aktivitu, což vede k relativně vysoké chybovosti při syntéze DNA a následně k rychlému vzniku mutací u RNA virů.
Struktura a domény
Typická reverzní transkriptáza má několik funkčních domén: polymerázovou doménu zodpovědnou za přidávání nukleotidů a doménu s RNázou H, která štěpí RNA v RNA–DNA hybridu. U některých enzymů (např. telomerázy) je součástí enzymu i vlastní krátký RNA templát.
Biologická role
Reverzní transkriptázy hrají klíčovou roli u retrovirů (např. HIV), které přepisují svůj RNA genom do DNA, jež se integruje do genomu hostitelské buňky. Podobné mechanismy používají retrotranspozony (např. LINE elementy) k replikaci a vložení kopií do genomu. Specifickým případem reverzní transkriptázy je telomeráza, enzym prodlužující telomery a využívající vlastní RNA jako templát pro syntézu telomerické DNA.
Aplikace v laboratoři
V molekulární biologii jsou reverzní transkriptázy nepostradatelné. Nejčastější použití zahrnuje:
- RT–PCR a kvantitativní qRT–PCR pro detekci a kvantifikaci RNA (např. virových genomů nebo expresních profilů genů).
- Syntézu komplementární DNA (cDNA) pro klonování, tvorbu knihoven cDNA a sekvenační aplikace (včetně RNA‑seq a single‑cell RNA‑seq).
- RACE (rapid amplification of cDNA ends) pro určování začátků a konců transkriptů.
Klinický význam a inhibitory
Reverzní transkriptázy jsou cílem antiretrovirové terapie. U HIV a některých dalších virů se používají dvě hlavní třídy inhibitorů:
- NRTIs/NtRTIs (nukleosidové/-tide inhibitory reverzní transkriptázy) — konkurují přirozeným nukleotidům a po jejich začlenění do rostoucího řetězce vedou k terminaci syntézy.
- NNRTIs (nenukleozidové inhibitory) — vážou se do hydrofóbní kapsy v enzymu a mění konformaci polymerázové domény, čímž snižují její aktivitu.
Kromě retrovirů má reverzní transkripční aktivitu i polymeráza viru hepatitidy B (HBV), která replikuje DNA viru přes pregenomovou RNA. Blokování RT u těchto virů je klíčové pro kontrolu infekce.
Historie
Objev reverzní transkriptázy v 70. letech 20. století (Howard Temin, David Baltimore) zásadně změnil chápání genetické informace a dokázal, že tok genetické informace může být i z RNA do DNA. Tento objev vedl k hlubšímu porozumění virové replice a položil základy moderních molekulárně‑biologických technik založených na syntéze cDNA.
Příklady dobře prozkoumaných reverzních transkriptáz
- HIV‑1 reverzní transkriptáza — hlavní cíl antiretrovirové terapie u HIV.
- HIV‑2 reverzní transkriptáza — podobná, ale odlišná struktura a farmakologie.
- Moloney murine leukemia virus (MMLV) / Moloney retrovirus RT — běžně používaná v laboratorních kitem pro syntézu cDNA.
- Avian myeloblastosis virus (AMV) RT — historicky hojně využívaná laboratorní RT.
- HBV polymeráza (s RT aktivitou) — replikuje genom hepatitidy B přes RNA mezistupeň.
- Telomeráza (TERT) — buněčný enzym s reverzní transkripční aktivitou zodpovědný za prodlužování telomer.
- RT proteiny retrotranspozonů (např. LINE‑1 ORF2) — umožňují mobilitu genetických elementů v genomu.
Praktické poznámky
Při práci s reverzní transkriptázou v laboratoři je důležité zvolit vhodný enzym podle požadavků (např. thermostabilní RT pro vyšší teploty a vyšší specifitu, RT s nízkou chybovostí pro klonování). Volba primeru (oligo‑dT vs. random hexamery vs. genově specifické) ovlivní pokrytí a reprezentaci cDNA. Vysoká chybovost některých RT může ovlivnit interpretaci výsledků u sekvenačních aplikací a je třeba ji zohlednit při navrhování experimentů.
Reverzní transkriptázy jsou tedy klíčové jak pro biologické pochopení retrovírusové biologie a buněčných procesů (např. telomerázová aktivita), tak pro široké spektrum praktických aplikací v diagnostice a výzkumu.
Krystalografická struktura reverzní transkriptázy HIV. Podjednotka P51 je zelená a podjednotka P66 je azurová.
Krystalografická struktura reverzní transkriptázy HIV.
Historie
Reverzní transkriptázu objevil Howard Temin z University of Wisconsin-Madison v rakovinném viru. Nezávisle ji izoloval David Baltimore v roce 1970 na MIT ze dvou nádorových RNA virů. Za své úspěchy se v roce 1975 podělili o Nobelovu cenu za fyziologii nebo medicínu (spolu s Renatem Dulbeccem).
Myšlenka reverzní transkripce byla zpočátku velmi nepopulární, protože byla v rozporu s hlavním dogmatem molekulární biologie. To říká, že DNA je přepisována do RNA, která je následně překládána do proteinů. Když však v roce 1970 Howard Temin a David Baltimore nezávisle na sobě objevili enzym zodpovědný za reverzní transkripci, byla možnost, že genetická informace může být předávána tímto způsobem, konečně přijata.
Z této práce vzešla myšlenka, že první genomy byly tvořeny geny RNA. RNA geny, které se dochovaly do dnešních dnů, jsou možná jediné, co z tohoto raného stavu zbylo. Reverzní transkriptáza by mohla být pozůstatkem fáze, kdy geny DNA vznikaly kopírováním genů RNA. Tato teorie se týká nejranějších stadií evoluce. Reverzní transkripci využívají také různé polonezávislé elementy zvané transpozony.
Vyhledávání