Hra začíná tím, že se Chell probudí v malé prosklené místnosti, ve které je pouze postel, toaleta a rádio. GLaDOS jí řekne, že brzy začne testování, a na jedné ze stěn se otevře oranžový portál. Jakmile jím hráč projde, vstoupí do testovacích místností a začne testování. Celkem je zde 20 testovacích místností, nazývaných testovací komory.
Testy začínají jednoduše. Chell musí posbírat krabice, zvané Weighted Storage Cubes (zkráceně Cubes), a položit je na tlačítka, která otevřou dveře k východu z komory. V tomto okamžiku k Chell promluví GLaDOS jako průvodce, pochválí ji a slíbí jí dort, až testy skončí. Téměř na začátku hry Chell získá ruční portálové zařízení Aperture Science, známé také jako Portal Gun. Zpočátku její Portal Gun vytváří pouze modré portály a oranžové portály vytváří GLaDOS. Později Chell získá kompletní Portal Gun a může vytvářet modré i oranžové portály.
V průběhu hry se testy stávají stále nebezpečnějšími. V některých místnostech je na podlaze jed. V jiných jsou elektrické koule zvané High Energy Pellets, které Chell zabijí, pokud se jich dotkne. Během těchto testů je GLaDOS stále sarkastičtější a dává Chell zbytečné rady, například: "Tady ta podlaha tě zabije. Snaž se jí vyhnout." V jednu chvíli GLaDOS řekne Chell, že komora je rozbitá a místo toho musí projít komorou plnou strážních zbraní, zvaných Věže. Pokud nějaká věžička Chell uvidí, bude na ni střílet, dokud nezemře. V této komoře se nachází skrytá místnost. Ve skryté místnosti jsou na stěnách kresby a nápisy zanechané neznámou osobou. Nápisy říkají věci jako "dort je lež" a "ona se vždycky dívá" s obrázkem kamery. V pozdějších komnatách je podobných místností více.
V další komnatě musí Chell k vyřešení testu použít Váženou kostku společníka, která vypadá jako Vážená kostka se srdíčky. Během testu GLaDOS několikrát Chell řekne, že Companion Cube není živá, ale na konci testu Chell řekne, že musí Companion Cube "zabít", aby se dostala k dalšímu testu.
Při posledním testu musí Chell stát na pohyblivé plošině. Na konci dráhy plošiny ji plošina přenese do ohnivé jámy. GLaDOS poděkuje Chell za provedení testů. V poslední chvíli Chell použije svou portálovou zbraň, aby unikla z pasti. Při pokusu o útěk z budovy je Chell zavedena do místnosti, kde najde GLaDOS. Chell rozbije bílou kouli, která vypadla z GLaDOSu. GLaDOS jí řekne, že byla hloupá, když ji rozbila, protože nevěděli, co to je, ale GLaDOS rychle zjistí, že to bylo její morální jádro. Řekne Chell, že ji tam nainstalovali lidé, kteří pracovali pro Aperture Science, aby je přestala zabíjet "smrtícím neurotoxinem". Protože ho Chell rozbila, může GLaDOS Neuro-Toxin znovu používat. Chell má časový limit 6 minut na to, aby zabil GLaDOS, než Neuro-Toxin zabije Chell. Poté, co z ní odlomí kusy a spálí je, je GLaDOS zničen a Chell uniká z budovy.
Poté, co Chell unikne, omdlí a robot ji odtáhne zpět do budovy. Během titulků zpívá GLaDOS píseň "Still Alive", kterou napsal Jonathan Coulton a která říká, že i když ji Chell zabila, je stále naživu.
