Kofaktor (nebo kofaktor) je chemická sloučenina, která není bílkovinou, ale je k bílkovině připojena. Sloučenina je potřebná pro biologickou aktivitu bílkoviny. Ve většině případů je bílkovinou enzym a kofaktor pomáhá enzymu pracovat. V takovém případě se kofaktory nazývají také koenzymy.

Kofaktory, které jsou složitými organickými molekulami, se často nazývají koenzymy. Pokud jsou spojeny kovalentní vazbou, jedná se o prostetickou skupinu. Pokud jsou však spojeny pouze dočasně, pak je kofaktor kosubstrátem.

Některé enzymy potřebují několik kofaktorů. Organické kofaktory jsou často vitamíny nebo jsou z nich vyrobeny. Kovové ionty jsou často kofaktory, ale mnoho kofaktorů má jak anorganickou, tak organickou část.